1-14. 유전자 조작

유전자 클로닝	* 유전자 조작은 다른 생물의 DNA 가닥에서 잘라낸 DNA 단편(외래유전자)을 운반체 DNA(벡터)에 연결하여 재조합 DNA를 만들고, 그 재조합 DNA를 숙주세포에 도입하여 증식하는 과정을 통해 이루어짐 * 유전자 클론화 * 특정 유전자의 대량 복제를 위해 쓰이는 중요한 DNA 재조합 기술
클론(clone)	유전자클로닝에 의해 증식된 세포집단
유전자클로닝 재료	외래 유전자(DNA), 제한효소(가위 역할), 연결효소(풀 역할), 벡터, 숙주세포

1. 재조합 DNA

 1) 제한효소

• 제한효소는 원핵세포에서 생산되는 DNA 절단효소로 이제까지 400여 종류가 발견됨
• 제한효소는 DNA의 특정 염기서열(제한부위)을 인지하여 절단함
• 제한부위의 염기서열을 엇갈리게 절단하여 한 가닥의 점착성 말단을 가진 DNA 단편을 만듬
• 이 DNA 단편은 상보적인 점착성 말단을 가진 다른 DNA와 결합하여 재조합 DNA를 만듬

 2) 연결효소

• DNA 가닥에 인접한 뉴클레오티드의 3' 말단 -OH기와 5' 말단 -인산기를 인산2에 에스테르 결합으로 연결시켜 끊어진 DNA의 당-인산 골격을 공유결합시키는 효소
• DNA 연결효소는 DNA 불연속복제, 손상된 DNA 회복, 유전자 조작에 의한 DNA 재조합 등에 중요 역할 함
• 연결효소는 모든세포에서 생성되는데, 유전자 조작에서 대장균과 T4파지의 연결효소를 주로 사용함

 3) 벡터

• 벡터 : 외래유전자(DNA 단편)를 숙주세포로 운반해 주는 유전자 운반체
• 벡터의 조건   

  벡터의 조건	* 외래 유전자를 삽입하기 쉬워야 함
  	* 숙주세포에서 자기증식을 할 수 있어야 함
  	* DNA 재조합형을 식별할 수 있는 표지유전자를 가지고 있어야 함

• 유전자클로닝에 많이 사용되는 벡터 : 대장균박테리아를 숙주로 하는 플라스미드(plasmid), 박테리오파지(bacteriophage)

 4) 유전자 클로닝

• 외래유전자(DNA 단편)를 벡터에 연결시켜 재조합 DNA를 만든 다음 그것을 숙주박테리아에 주입한 후 형질전환세포를 선발하여 증식시킴(주입시 박테리아에 50mM(밀리몰) 정도의 염화칼슘(CaCl2)을 처리하면 세포막의 투과성이 높아져 DNA가 잘 흡수됨)
• 숙주박테리아 속으로 들어간 제조합 DNA는 숙주세포가 분열할 때마다 함께 복제되어 대량 증식함으로써 형질전환세포의 클론이 만들어짐

2. 유전자 은행(DNA library)

 1) 유전자 은행

• 특정한 DNA 단편(유전자)의 클론을 모아 놓은 유전자의 집단
• 게놈라이브러리 : 생물체의 게놈을 특정한 제한효소로 절단한 모든 DNA 단편을 벡터에 삽입하여 만든 유전자 은행이며, 생명체의 유전자를 원래대로 모두 갖고 있음.
• cDNA 라이브러리 : 서로 다른 유전자를 가지고 있는 클론 집단. 역전사효소를 이용하여 특정한 조건에서 발현된 유전자의 mRNA를 모두 역전사시켜 합성한 cDNA(complementary DNA, 상보적인)의 집단이며, 게놈의 일부분만을 포함함
• 유전자 도서관은 유전자 조작을 위해 꼭 필요하며, 유전자도서관에서 필요한 유전자를 찾기 위해 DNA 프로브(probe)가 있어야 함

 2) 프로브(probe, 탐침)

• 유전자 은행에서 원하는 유전자를 찾아내기 위해 사용하는 방사능을 띤 상보적인 한 가닥 DNA 단편, 즉 찾고자 하는 DNA에 상보적인 한 가닥 DNA 단편
• 프로브는 인공합성을 하거나 mRNA로부터 합성하거나 다른 생물의 유전자를 이용함

 3) 역전사

• 전사(RNA 합성)와는 반대로 mRNA를 주형으로 삼아 뉴클레오티드를 삽입시킴으로써 그것에 상보적인 DNA(cDNA)를 합성하는 반응
• 역전사를 촉매하기 위해 역전사효소(역전사바이러스에서 분리)를 사용
• 역전사 효소는 대부분 RNA 종양바이러스에 존재함
• 유전자 조작에서는 역전사효소를 이용하여 유용단백질을 생산하는 mRNA로부터 cDNA를 합성하며, 이 cDNA를 유전자운반체에 연결시켜 형질전환을 유도함